茶树炭疽病原菌的绿色荧光蛋白基因标记及其侵染研究

茶树炭疽病原菌的绿色荧光蛋白基因标记及其侵染研究

【摘要】： 茶Camellia sinensis(L.)O.Ktze.,是常绿双子叶木本植物,茶起源于中国,传播至全世界,成为世界人们喜爱的健康饮品之一。其中茶炭疽病是茶树上的叶部病害之一,炭疽菌属(Colletotrichum Corda)是分生孢子盘具有刚毛的全球性分布的植物病原菌,在茶树上发生严重时则会导致茶叶品质和质量的下降,造成一定的经济损失,因此炭疽菌在植物病原菌中占有较重要的地位。真菌侵入寄主的机制主要分为直接侵入,自然孔口(气孔,排水孔,皮孔,柱头,蜜腺等),伤口侵入,还有些病原菌先侵入坏死组织中,生活与繁殖一段时间再侵染健康叶片。Green fluorescent protein(GFP)标记茶树上的病原菌研究及其侵染茶叶的途径未见报道,本文主要通过对茶叶胶孢炭疽菌GFP标记,对其侵染茶叶展开一系列研究。主要研究如下:1.茶园采集茶树上的炭疽菌症状的叶部病害,经过组织分离,纯化培养,分离菌株致病性测定表明其具有致病性,形态鉴定结合分子构建多基因(ITS、ACT、CAL、CHS-1、TUB2、GAPDH)系统发育树鉴定GZCC20-0218为一株胶孢炭疽菌。2.供试菌胶孢炭疽菌经过潮霉素(HygB)的抗性测定后得出潮霉素浓度为450μg/ml可以作为GFP标记的转化子菌株的初筛选浓度。本研究在0.2 M乙酰丁香酮、农杆菌菌液OD600达到0.5~0.6范围、分生孢子悬浮液浓度为106spores/ml等条件下,根癌农杆菌与供试菌在乙酰丁香酮(AS)诱导培养下得到转化子,转化子在荧光显微镜检测荧光现象,PCR扩增潮霉素特异性的引物得到的产物进行电泳检测,荧光蛋白在供试菌株里成功的表达。转化子连续培养6~7代后对转化子的GFP遗传稳定性测定后,从而获得稳定遗传的GFP标记菌株。3.比较GFP标记菌株和GZCC20-0218供试菌的生物学特性,两者的菌株形态特征,并借助SAS分析软件,得出在P=0.05水平上表明两者平均生长速度无显著性差异。同时,GFP标记菌株仍具有致病性。4.获得稳定遗传的GFP标记菌株进行侵染活体茶苗的试验,7 d之后发病率达到100%。发病叶片进行组织切片观察,发现胶孢炭疽菌的分生孢子可以在叶片的气孔和叶片组织内定殖。

【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2020

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