合浦珠母贝TGFβ信号通路相关基因的克隆及功能研究

【摘要】： 合浦珠母贝(Pinctada fucata)中已被鉴定的基质蛋白多达数十种,它们参与一系列贝壳和珍珠形成的过程。因此,研究贝中信号通路对基质蛋白表达的调控作用,将为软体动物生物矿化分子机制的研究提供一个新的突破口。本研究一方面对合浦珠母贝TGFβ信号通路相关基因进行克隆和功能研究;另一方面对该贝若干基质蛋白的启动子序列进行克隆、生物信息学分析和启动子活性研究,为鉴定贝中参与基质蛋白转录调控的TGFβ信号通路提供了重要的信息。利用聚合酶链式反应(PCR)和cDNA末端快速扩增方法(RACE),分别得到合浦珠母贝TGFβ超家族成员Pf-ALR1和Pf-Smad3的cDNA全长,它们各自功能区的氨基酸序列非常保守。半定量反转录PCR结果表明Pf-ALR1和Pf-Smad3基因在贝中广泛分布,且在胚胎发育阶段、贝壳修复过程和珍珠囊形成过程中的mRNA表达量有显著变化。原位杂交结果表明Pf-ALR1和Pf-Smad3基因均在外套膜中褶的外表皮细胞和外褶的内表皮细胞有较高表达水平。药物刺激实验和RNA干扰试验表明,Pf-Smad3的mRNA表达水平与多种基质蛋白和贝engrailed、NF-κB信号通路的相关因子的mRNA表达水平呈正相关性,且特异性抑制Pf-Smad3的mRNA表达水平可导致基质蛋白KRMP的mRNA表达水平显著降低。上述结果提示,Pf-ALR1和Pf-Smad3基因可能在合浦珠母贝的各种生理活动中,包括在贝壳和珍珠形成的生物矿化过程中,都发挥重要作用。利用特异引物PCR获得了合浦珠母贝基质蛋白KRMP的一段5’-UTR序列,序列比对显示该序列含有一段约200 bp的在该贝另外两个基质蛋白Pearlin和Prisilkin-39的启动子序列中也存在的保守片段。通过软件还预测出KRMP的核心启动子序列以及两个Sox结合位点。通过荧光素酶报告体系检测出所获得的KRMP的启动子序列在鼠细胞中具有较高的转录活性,且过量表达Pf-Smad3可显著提高该启动子的活性以及鼠Sox9的mRNA表达水平。因此贝中可能存在通过激活Smad3基因表达,进而提高贝Sox同源基因表达水平,最终增强KRMP等基质蛋白转录水平的信号通路。本研究结果为揭示调控贝中基质蛋白基因表达的信号调控网络提供了基础,也为选择药物刺激外套膜分泌珍珠质以提高珍珠质量提供了理论依据。

【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010

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