急性白血病环状RNA表达谱及应用初步研究
【摘要】： 第一章 急性白血病环状RNA表达谱及差异表达环状RNAs的初步验证目的:(1)通过环状RNA(circRNA)表达谱芯片获得急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)及健康志愿者的环状RNA表达谱,初步明确它们之间是否存在差异。(2)筛选出ALL与正常对照、AML与正常对照以及ALL与AML之间差异表达的circRNAs。(3)对筛选出具有潜在价值的circRNAs进一步扩大样本进行验证。方法:(1)收集3例初发ALL、5例初发AML及3例正常对照的骨髓单个核细胞标本用于circRNA表达谱芯片,通过生物信息学方法分析并筛选出差异表达的circRNAs。(2)采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术对用于芯片检测的11例样本进行部分差异表达circRNAs表达量检测。结果:(1)ALL与正常对照对比,一共有1639个circRNAs差异表达,其中647个表达上调,992个表达下调;AML与正常对照对比,共有32个circRNAs差异表达,其中21个表达上调,11个表达下调;ALL与AML对比,共有259个circRNAs差异表达,其中153个表达上调,106个表达下调。(2)非监督聚类分析结果显示ALL、AML与正常对照及ALL与AML的circRNA表达谱之间存在明显差异。(3)RT-q PCR初步验证结果与芯片结果基本一致:与AML和正常对照对比,hsa＿circ＿0074816、hsa＿circ＿0001857、hsa＿circ＿0025630、hsa＿circ＿0000825、hsa＿circ＿0005507、hsa＿circ＿0001626、hsa＿circ＿0001055、hsa＿circ＿0001858、hsa＿circ＿0008362、hsa＿circ＿0001681、hsa＿circ＿0001583等11个circRNAs在ALL中表达上调,hsa＿circ＿0004087和hsa＿circ＿0012152在ALL中表达下调。结论:(1)Circ RNAs在ALL、AML及正常人骨髓样本中广泛且差异表达,circRNA表达谱可将AL从正常人中鉴别出来,并且可以鉴别ALL与AML。(2)芯片结果具有较高的可信度,部分circRNAs或许可以作为AL的辅助诊断和分型标记物。第二章 Hsa＿circ＿0001857与hsa＿circ＿0012152作为急性白血病诊断标记的诊断效能及其与临床资料的关系目的:(1)明确hsa＿circ＿0001857与hsa＿circ＿0012152作为AL诊断标记及ALL与AML分型诊断标记物的诊断效能。(2)探索hsa＿circ＿0001857和hsa＿circ＿0012152与白细胞计数、血红蛋白水平及血小板计数等临床实验室指标之间的关系。方法:(1)收集40例初发ALL、44例初发AML及5例正常对照的骨髓单个核细胞,应用RT-q PCR技术对其进行hsa＿circ＿0001857与hsa＿circ＿0012152表达水平测定,采用ANOVA分析及ROC(receiver operating characteristic curve)曲线等统计学方法分析hsa＿circ＿0001857和hsa＿circ＿0012152作为AL的诊断及分型诊断标记物诊断效能及其与临床实验室指标的关系。结果:(1)Hsa＿circ＿0001857在ALL中的表达水平比AML(12.73 vs.0.28,P<0.0001)及正常对照(12.73 vs.0.24,P<0.05)明显升高,并且可以灵敏度、特异度及AUC(area under the curve)值分别为0.875、0.909、0.9091(95%CI:0.8340-0.9842,P<0.0001)的诊断效能鉴别ALL与AML,但尚不能作为ALL的诊断标记(AUC=0.7350,P=0.0896)。(2)Hsa＿circ＿0012152在AML中表达水平明显比ALL(44.63 vs.0.27,P<0.0001)及正常对照(44.63 vs.1.04,P<0.05)高,且可以诊断效能为0.977的灵敏度、1.000的特异度、0.9773(95%CI:0.9332-1.0000,P=0.0005)的AUC值诊断AML,可以灵敏度、特异度、AUC值分别为0.775、0.886、0.8625(95%CI:0.7741-0.9509,P<0.0001)的诊断效能鉴别ALL与AML。(3)采用串联诊断实验联合hsa＿circ＿0001857和hsa＿circ＿0012152来鉴别ALL和AML时,特异度可提高至0.977;采用并联诊断实验联合二者,灵敏度可提高至0.950;采用logistic预测模型联合二者,AUC值可提高至0.9489(95%CI:0.8949-1.000,P<0.0001)。(4)在ALL患者中,hsa＿circ＿0001857低表达组患者更年轻(24岁vs.61岁,P=0.013),而在性别、骨髓原始细胞水平、血红蛋白水平、WBC计数及血小板计数等方面hsa＿circ＿0001857高、低表达两组之间无明显差异。在AML中,hsa＿circ＿0012152低表达组血红蛋白水平比高表达组高(95 g/L vs.78 g/L,P=0.026),而在年龄、性别、骨髓原始细胞水平、WBC计数、血小板计数及FAB分型等方面两组无明显差异。结论:(1)Hsa＿circ＿0012152是潜在的AML诊断标记及ALL与AML分型诊断标记。Hsa＿circ＿0001857是潜在的ALL与AML分型分子标记,联合hsa＿circ＿0001857与hsa＿circ＿0012152,可提高对AL分型的诊断效能。(2)在ALL中,年轻患者的hsa＿circ＿0001857表达水平可能更低,在AML中hsa＿circ＿0012152低表达的患者血红蛋白水平可能更高。第三章 差异表达环状RNAs的生物信息学研究目的:对hsa＿circ＿0012152进行功能预测及分析,构建ce RNA(competing endogenous network,内源竞争性RNA)网络,寻找潜在的作用机制。方法:(1)通过star Base数据库预测与hsa＿circ＿0012152相互作用的靶miRNA及与miRNA作用的靶基因,然后利用Cytoscape软件中的cyto Hubba插件寻找hub基因并构建ce RNA网络。(2)利用R语言对靶基因进行GO及KEGG功能富集分析。结果:(1)Star Base数据库预测发现miR-491-5p和miR-512-3p等11个miRNA可与hsa＿circ＿0012152结合,除miR-6763-5p没有检索到靶基因外,另外10个miRNA一共预测到1862个靶基因。(2)对靶基因进行PPI(protein protein interaction network)分析显示TP53、MAPK1、PPP2R1A、CREBBP、CUL1、HIST2H2BE、POLR2C、PIK3R1、H2AFV、EGFR等10个基因为hub基因,10个hub基因有5个为miR-491-5p的靶基因,3个为miR-512-3p的靶基因,且miR-491-5p和miR-512-3p均可与hub基因MAPK1和EGFR结合。(3)GO与KEGG富集分析提示miR-491-5p和miR-512-3p靶基因发挥“共价染色体修饰”、“组蛋白修饰”、“Ras蛋白信号转导”及“髓系细胞分化”等功能,参与“人乳头瘤病毒感染”、“乙型肝炎病毒感染”、“PI3K-Akt”、“MAPK”、“TGF-β”等通路。结论:Hsa＿circ＿0012152可能通过miR-491-5p/EGFR/MAPK1轴或miR-512-3p/EGFR/MAPK1轴参与AML的发生发展。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2020
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