PAX2基因沉默在梗阻性肾病肾小管上皮细胞转分化中作用机制的研究

【摘要】：前言梗阻性肾病(Obstructive nephropathy)是由于泌尿道结构和(或)功能改变,阻碍尿液的排出,导致肾实质病理和功能损害的临床综合征。梗阻性肾病不是一个独立原发病,是由不同病因疾病引起的共同临床表现。梗阻性肾病是引起儿童慢性肾衰竭常见的原因。据北美统计,儿童梗阻性肾病占儿童终末期肾脏疾病的0.3%,占儿童肾移植的16.1%,这给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此,延缓、阻止甚至逆转梗阻性肾病的进展具有重大的经济和社会意义。许多学者通过体内外实验研究表明,肾间质纤维化是梗阻性肾病最终的共同途径。迄今为止,虽然对肾小管间质纤维化进行了大量的研究,但对其发生机制仍未完全阐明,目前认为肾小管上皮细胞-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肾间质纤维化的重要发病机制之一。肾脏损伤后组织病变过程类似于胚胎后肾发育过程的重演,即成熟肾脏在病理状态下,一些在肾脏胚胎发育过程中高表达的因子、蛋白(prepro-EGF、Tamm-Horsfall protein、PAX-2 protein等)重新高表达,并且转分化表达胚胎间充质细胞表型,而丧失成熟细胞的标志,这一过程类似于胚胎肾的生理发育过程中后肾间充质细胞向上皮细胞转化(mesenchymal epithelial transition, MET)的逆转。PAX2 (Paired Box2)基因编码核转录因子,是肾脏胚胎发育过程中诱导肾小管上皮细胞转分化的关键性发育基因之一,在前、中、后肾发育的全过程中表达,参与胚胎肾脏各个发育阶段的调控,成熟肾单位PAX2表达消失。近来发现,PAX2在肾间质纤维化模型中出现重新表达,但在PAX2的表达部位以及PAX2的重新表达对肾损害的影响方面存在分歧。单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)造成肾梗阻是诱导肾间质纤维化经典的模型,是目前应用最为广泛的研究肾间质纤维化发生机制、肾脏细胞转分化和评价肾纤维化治疗方法的实验动物模型。本研究建立UUO大鼠模型明确PAX2表达的具体部位,以及重新表达与梗阻性肾病肾间质纤维化之间的关系；并应用RNA干扰技术沉默梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞PAX2基因,探讨PAX2基因沉默对肾间质纤维化程度及肾功能的影响,阐明PAX2基因沉默在肾小管上皮细胞转分化中的作用。材料和方法一、动物模型与分组雄性Wistar大鼠168只(120-150克,4-6周),购自中国医科大学附属盛京医院实验动物中心。以随机排列表法随机分为：模型组(UUO)32只和假手术组(sham组)32只,于术后3d、5d、7d、14d分为4组,每组8只；根据siRNA的设计的位点不同分为五组,即siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和阴性对照组,每组8只；沉默组(RNAi)32只和阴性对照组(NC)32只,于转染后3d、5d、7d、14d分为4组,每组8只。模型组(UUO组)：以单侧输尿管结扎制作梗阻性肾病模型,10%的水合氯醛(300 mg／kg)腹腔注射麻醉后,行左侧耻骨上切口,沿左肾下极寻找到左输尿管,用4-0号丝线上下结扎两处,从中剪断输尿管以防逆行性感染,分层缝合关闭腹腔。假手术组(sham组)：分离输尿管不结扎,随即缝合腹腔。siRNA1、siRNA2. siRNA3. siRNA4口阴性对照组：在制作模型后,立即将装有200μl PAX2-siRNA-invivo jetPEI复合物注入肾被膜下,分层缝合关闭腹腔。沉默组(RNAi):在制作模型后,立即将装有200μl PAX2-siRNA3-invivo jetPEI复合物注入肾被膜下,分层缝合关闭腹腔。阴性对照组(NC)：在制作模型后,立即将装有200μl NC-siRNA-invivo jetPEI复合物注入肾被膜下,分层缝合关闭腹腔。二、标本的采集和处理1、肾组织各组大鼠于术后或转染后3d、5d、7d、14d给予10%水合氯醛0.3ml／kg腹腔注射麻醉,处死大鼠。腹部常规消毒,无菌条件下留取左侧肾组织,以无菌生理盐水冲洗,剥离表面脂肪,滤纸吸干表面水分,一部分置4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,待做病理形态学检测和免疫组化。一部分剥离表面脂肪后分离肾脏皮质和髓质,包入无菌锡纸中置液氮罐内,再转移至-80℃冰箱,待做实时荧光定量PCR和Western blot。2、尿大鼠于转染后1d、2d、3d、5d、7d和14d置于代谢笼中收集24小时尿液,新鲜尿样以3000rpm速度离心15min,去沉渣,-80℃冰箱保存,用以测尿β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2-MG)含量。3、血大鼠转染后1、2d末在乙醚实施浅麻醉下用毛细玻璃管采大鼠内呲静脉血1ml采血；转染后3d、5d、7d和14d末腹主动脉采血4ml,3000转／分离心,血清置于-80℃冰箱保存,用以测血肌酐含量。三、实验方法及检测指标1、各组动物在不同时间点的大体观察,包括肾脏颜色,表面是否光滑,包膜是否完整,有无肾积水、肾实质变薄、肾盂肾盏受压等。2、HE染色光镜观察肾小管间质损伤程度。3、Masson染色光镜观察肾间质纤维化程度。4、免疫组化法测肾皮质PAX2、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。5、Western blot法测定肾皮质PAX2、E-cadherin和α-SMA蛋白相对表达量。6、实时荧光定量PCR法测肾皮质(?)PAX2mRNA、E-cadherin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量。7、肾功能检测：尿β2-MG含量与血肌酐含量,采用中国医科大学附属盛京医院检验科全自动生化分析仪一次性检测。8、荧光显微镜观察PAX2-FAM-siRNA-PEI在肾组织内转染情况。四、统计学分析实验数据采用均数士标准差表示,应用SPSS13.0统计软件,组间比较采用t检验,各组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两变量相关分析采用Pearson相关分析,P<0.05有统计学意义。结果一、肾组织形态学改变(一)大体观察UUO组大鼠肾脏随着时间延长体积逐渐增大,颜色变灰白、无光泽,表面不光滑,颗粒感明显,可见肾积水,肾实质变薄,肾盂扩张,肾盏乳头受压,穹隆部乳头变平钝,部分成凹型；sham组大鼠肾脏呈深红色,表面光滑,包膜完整,与肾实质不粘连,切面皮髓分界清晰。(二)光镜下肾脏病理变化HE和Masson染色观察到尿路梗阻后肾脏纤维化表现：肾间质弥漫性巨噬细胞、淋巴细胞浸润；肾小管扩张、萎缩、管腔塌陷；肾间质增宽、胶原纤维的沉积等。证明本实验UUO模型造模成功。二、PAX2蛋白和mRNA在UUO大鼠肾脏中的表达情况免疫组化观察sham组PAX2蛋白在肾小管上皮细胞无表达,在集合管上皮细胞核内较多表达；UUO组术后3d在肾小管上皮细胞可见PAX2蛋白表达,术后14d表达更加明显(P<0.05)；且显著高于sham组(P<0.05)。Western blot结果显示,PAX2蛋白水平在UUO组术后3d相比sham组明显的增加(P<0.05),随着梗阻时间延长PAX2蛋白表达更加明显；Realtime PCR结果显示,PAX2 mRNA与PAX2蛋白的表达趋势相同。三、PAX2蛋白与肾间质纤维化程度的相关性分析PAX2蛋白表达量与肾小管损伤评分和肾间质相对面积进行Pearson相关分析,结果表明：PAX2蛋白与肾小管损伤程度呈正相关(r=0.991,P<0.05)和肾间质纤维化程度呈正相关(r=0.985,P<0.05)。四、PAX2-siRNA-PEI复合物的筛选与鉴定(一) PAX2-siRNA-PEI在肾组织内转染情况FAM-siRNA-PEI和NC-siRNA-PEI注射体内3天后取肾脏,立即制作冰冻切片,放置于荧光显微镜下观察,注射FAM-siRNA-PEI的肾脏内可见肾小管周围存在绿色荧光,注射NC-siRNA-PEI'肾脏未见荧光。(二) PAX2-siRNA-PEI对PAX2 mRNA和蛋白的抑制效果利用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测肾组织PAX2 mRNA及蛋白表达,四对干扰序列均有不同程度的抑制肾皮质]PAX2 mRNA及蛋白的表达,其中siRNA3位点对PAX2干扰效果最强,mRNA及蛋白抑制分别达到55%和81%。五、PAX2-siRNA3-PEI转染后各时间点PAX2基因沉默的鉴定化学合成的PAX2-siRNA3和阴性对照siRNA与in vivo jetPEI复合物转染UUO大鼠体内,荧光定量PCR和Western blot检测转染后不同时间点PAX2 mRNA和蛋白表达,结果沉默组与同期对照组相比PAX2 mRNA和蛋白表达量明显降低(P<0.05)。六、PAX2基因沉默对肾间质纤维化程度及肾功能的影响(一)肾间质纤维化程度HE和Masson染色观察到对照组随梗阻时间延长,肾小管病变逐渐加重,肾间质增宽明显,大量胶原纤维增生,胶原沉积更加显著。沉默组与同期对照组3d、5d、7d相比无明显变化(P>0.05)；在14d时沉默组与对照组相比肾小管扩张程度减轻、间质病变程度减低、胶原沉积程度显著降低、纤维化进程明显延缓(P<0.05)。(二)肾功能本实验分别于转染后第1d、2d、3d、5d、7d、14d末采血和留尿,检测对照组和沉默组大鼠血肌酐与尿β2-MG含量,结果显示：对照组和沉默组在转染后各时间点血肌酐水平有所波动,但无统计学差异(P>0.05)；尿β2-MG含量两组均从转染后第5d开始升高,沉默组与同期对照组相比在第1d、2d、3d、5d和7dβ2-MG含量无差异,第14d是沉默组明显低于对照组。七、UUO大鼠肾小管上皮-间充质转化(EMT)免疫组化、Western blot和实时荧光定量PCR法检测E-cadherin与a-SMA蛋白和mRNA表达,UUO组术后3d E-cadherin蛋白和mRNA的相对表达量减少,α-SMA蛋白和(?)nRNA的相对表达量增加；随着梗阻时间的延长E-cadherin表达量逐渐降低,α-SMA表达量逐渐增加；术后14d在肾皮质E-cadherin仅见微量表达,α-SMA表达显著,与sham组比较有统计学差异(P<0.05)；而UUO组各时间点的E-cadherin与α-SMA蛋白和mRNA的相对表达量比较有统计学差异(P<0.05)。八、PAX2基因沉默对UUO大鼠肾小管EMT的影响对照组随着梗阻时间的延长,E-cadherin蛋白和mRNA表达量逐渐下降,a-SMA蛋白和mRNA表达量逐渐升高；沉默组与同期对照组相比各指标在转3d、5d和7d无差异(P>0.05),在转染14d时,沉默组E-cadherin蛋白和mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.05),a-SMA蛋白和mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论1、胚胎发育基因PAX2在梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞存在重新表达,随着梗阻时间的延长PAX2表达更加明显。2、PAX2蛋白表达水平与肾小管损伤程度和肾间质纤维化程度呈正相关。3、In vivo jetPEI介导PAX2-siRNA注射大鼠肾被膜下可成功到达肾实质内。4、实时荧光定量PCR及Western blot技术检测转染后肾皮质的PAX2mRNA及蛋白表达,四对干扰序列均有不同程度的抑制作用,其中siRNA3位点对PAX2干扰效果最强,mRNA及蛋白抑制分别达到55%和81%。5、PAX2基因沉默在梗阻早期对肾间质纤维化程度的改变无明显作用,在梗阻的晚期可延缓其肾间质纤维化的进程、减轻肾小管损伤程度,对肾间质纤维化有明显治疗作用。6、PAX2基因沉默在梗阻晚期可以降低UUO大鼠尿中β2-MG含量,改善肾功能。7、UUO大鼠模型随着梗阻时间的延长,E-cadherin mRNA和蛋白的表达逐渐下降、α-SMA mRNA和蛋白的表达逐渐增加,即肾小管上皮细胞发生了EMT。8、PAX2基因沉默在梗阻早期对EMT无影响,在晚期可抑制肾小管EMT的过程,延缓肾间质纤维化的进程。9、PAX2在UUO大鼠模型肾小管上皮细胞重新表达具有修复损伤或加重病变的双重细胞生物学意义。

【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010

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